MTT 法测定细胞相对数和相对活力

一、原理

噻唑兰，简称 MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT 还原为难溶于水的蓝紫色的 Formazan 结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。

二、试剂材料准备与实验仪器

1. 对数生长期细胞
2. 受试因素（药物）
3. MTT：以 PBS 配制成 5mg /ml，抽滤除菌，保存在 4˚C
4. DMSO（二甲基亚砜）

5）96 孔板

6. 酶联免疫检测仪
7. 细胞培养箱

三、实验步骤（适用于贴壁细胞）

1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于 96 孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整。
2. 置 37℃、5%CO2 温箱培养使细胞贴壁。
3. 加入不同浓度的药物，如 1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml 的药物，时间依据实验需要，一般 3 天。
4. 小心吸去上清，PBS 轻轻洗涤，再次离心，弃上清。
5. 每孔加入 180 ul 新鲜 RPMI 1640 培养液，再加入 20 ul MTT 溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养 4 h。
6. 终止培养（可离心，1000 rpm，10 min），小心吸去孔内培养液。
7. 每孔加入 150 ul 二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS 代替），置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 490 nm 处测量各孔的吸光值。
8. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定 3 复孔。

3. 结果统计学处理

所有数值以 x±s 表示，应用 SPSS 软件进行方差分析，p<0.05 时为相差显著，p<0.01 时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求 IC50。或计算抑制率。

4. 注意事项与常见问题

1. 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。 对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
2. 每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降低，太少观察不到差异。
3. 贴壁细胞加 MTT 前吸掉培养液，悬浮细胞可以不吸除培养液，再加入 0.5%MTT，量为20ul/孔。
4. 如果不使用 96 孔板，培养基超过 100 ml，MTT 按照 10%的比例加入。
5. MTT 一般 4 度保存两周，注意避光保存，或配制成 5mg/ml 保存在-20 度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后可过滤一下。
6. 对于 DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm 有最大吸收值；而对于 SDS 和酸化异丙醇，则选用 570nm，并且建议以 655nm 作为参考波长。

7）96 孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。

8. 注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。
9. 没有去掉上清直接加 DMSO，沉淀会很难溶解。加 DMSO 前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，也可在倒之前先用平板离心机离心 96 孔板，2000r，5 分钟，然后吸掉上清。加入 DMSO 后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。
10. 为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种细胞，而不作为指标检测孔。
11. 除置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解外，可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可；或放入 37 度放孵箱 15 分钟溶解结晶。
12. 关于如何计算 IC50 方法有多种

(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

(2)Bliss 法:自己查阅书籍

(3) IC50 计算软件，见下面附件（暂时找不到了）

(4)自己用 EXCEL 做趋势线来求 IC50，关于 LD50 的方法与此相似！

(5)在线求 IC50 或 EC50：http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm

13）计算抑制率，公式[（对照-本底）-（给药-本底）]/（对照-本底）*100%.