细胞凋亡检测实验（Annexin V/PI 双染色法）

细胞凋亡检测可以：（1）用于肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本研究；（2）应用于临床诊疗，新药研制、生物制品开发、肿瘤放化疗、以及从促凋亡角度探索肿瘤的基因治疗；（3）对相关疾病的早期发现、放化疗的疗效评价具有举足轻重的地位。

1、实验方法和原理

细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使 PS 暴露在细胞膜外表面。PS 是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使 PS 暴露在细胞膜外。

Annexin V 是一种 Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V 具有易于结合到磷脂类如 PS 的特性。对 PS 有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的 PS。

PS 转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。

因此，可以建立一种用 Annexin V 结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除

试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。

2、实验材料、试剂、仪器和耗材

细胞；

HEPES 缓冲液、NaCl、CaCl2、PI、ANNEXIN V-FITC 试剂盒；

流式细胞仪。

3、实验步骤

一、试剂与仪器

1. 孵育缓冲液：10 mmol/L HEPES/NaOH，pH7.4，140 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl2。
2. 标记液：将 FITC- Annexin V（宝灵曼公司产品）和 PI 加入到孵育缓冲液中，终浓度均为 1 ug/ml。
3. 流式细胞仪。

二、实验步骤

1. 细胞收集：悬浮细胞直接收集到 10 ml 的离心管中，每样本细胞数为（1~5）×106/mL 500~1 000 r/min 离心 5 min，弃去培养液。 
2. 用孵育缓冲液洗涤 1 次，500~1 000 r/min 离心 5 min。
3. 用 100 ul 的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育 10~15 min。 
4. 500~1 000 r/min 离心 5 min 沉淀细胞孵育缓冲液洗 1 次。 
5. 加入荧光（SA-FLOUS）溶液 4℃下孵育 20 min，避光并不时振动。 
6. 流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用 488 nm，用一波长为 515 nm 的通带滤器检测 FITC 荧光，另一波长大于 560 nm 的滤器检测 PI。 
7. 结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如 PI 有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的 DNA 可被 PI 着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期 PI 不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。